水凝胶机械性能测试（压缩、拉伸等）

水凝胶理化表征（微观形貌、吸水、溶胀等）

水凝胶中活性物质的释放行为表征

水凝胶微针降解能力表征

水凝胶微针性能优劣评价

水凝胶微针药物释放行为表征

水凝胶微针机械强度表征

水凝胶微针吸水能力表征

水凝胶微针溶血测试表征

水凝胶促成骨（体内）能力表征

水凝胶促成骨（体外）能力表征

水凝胶成软骨能力表征

水凝胶抗氧化性能表征

水凝胶抗菌性能表征

水凝胶粘附性能表征

负载型水凝胶中活性物质（药物、生长因子、外泌体）的释放行为表征

在往期内容中，EFL为大家区分讲解了应用于不同活性物质负载与控释的光固化水凝胶载体选择及负载方式的差异（【负载与控释】应用中光固化水凝胶如何选择？）。但是如何检测水凝胶体系中活性物质的释放行为（如释放量，释放速率等），又有哪些检测方法呢？在本期，EFL为大家介绍不同活性物质（药物、生长因子、外泌体）释放行为的检测方法，让非相关专业研究人员能在相关释放行为的检测方面得心应手。

通用测试方式（透析）

药物、生长因子、外泌体这类活性物质的体外释放行为监测均可通过透析法来检测。具体如下：类似于图1所示方法，释放介质可选择PBS、生理盐水等，通常将负载活性物质的凝胶置于透析袋（PS:透析袋的截留分子量需大于活性物质的分子量）内，再将其浸于装有释放介质的离心管中，也可直接将凝胶置于释放介质中。然后将透析装置置于恒温振荡培养箱内，根据模拟机体环境要求设置相应参数（温度、振荡速度等）。在设定时间内对释放介质取样进行浓度测定，并补充相同体积、温度和pH的释放介质，使释放介质的总体积保持不变。

图1 透析法测试药物负载型凝胶的药物释放行为^[1]

药物类检测方法

1. OD值检测法

若负载的药物含有紫外、荧光吸收峰，可通过紫外光谱仪、荧光光谱仪、高效液相色谱仪（HPLC）等仪器计算释放介质中的浓度。根据测得的数据计算药物累积释放率，并采用绘图软件绘制释放曲线（PS:需首先建立目标药物浓度与仪器吸光度值之间的标准曲线）。

2. 电化学方法

药物释放行为检测中，电化学方法提供了快速原位测量的可能性，同时避免了释放介质中未溶解分子的存在所造成的干扰。类似于图2所示方法，可将负载药物的凝胶置于三电极体系装置中，原位实时监测释放介质的药物含量。如可利用方波伏安技术测定盐酸阿霉素（DOX）的氧化还原反应进而测试DOX的释放行为^[2]。缺点是不同电化学测试方法的技术灵敏度和响应能力差别很大。此外，所使用的传感器可能只针对特定的药物^[1]。

图2 电化学测试DOX的释放行为装置图^[2]

生长因子类检测方法

1. 酶联免疫法（ELISA）

释放介质中生长因子的定量检测通常通过ELISA法实现，即对应的生长因子试剂盒检测释放介质中的目标生长因子含量^[3]。

外泌体检测方法

1. 免疫染色法

如何可视化监测水凝胶中负载的外泌体在释放过程是否被细胞吞噬掉？可利用外泌体的本身结构特性（具有脂质双层膜的微小囊泡）进行免疫着色后观察。研究中常用PKH26外泌体红色荧光标记染料对外泌体进行荧光标记，监测细胞吞噬作用^[4]。

图3 PKH26荧光标记外泌体在GelMA-PPY-Exosomes (GMPE)水凝胶及神经干细胞细胞质的可视化分布^[4]

2. BCA法蛋白定量检测

释放介质中外泌体的释放曲线通常采用BCA（二奎啉甲酸）法进行测定^[5]。简要原理为在碱性环境下外泌体中的蛋白质与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有较高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

图4 BCA法测试GelMA水凝胶中细胞外囊泡（sEVs）的释放曲线^[5]

3. 酶联免疫法（ELISA）

研究表明，几种四跨膜蛋白，尤其是CD63、CD81和CD9被认为是外泌体的标志物^[6]，因此可选用对应的ELISA试剂盒进行定量测定外泌体的释放曲线。

图5 PKH67标记GelMA凝胶中HUVECs-Exos及ELISA法测试GelMA水凝胶中Exos的释放曲线^[8]

下面，列举一些在检测活性物质（药物、生长因子、外泌体）的应用实例。

1. Advanced Healthcare Materials：GelMA-β-环糊精基微针贴片用于递送疏水药物

研究材料：羧甲基β-环糊精、GelMA

目标药物：疏水性药物-姜黄素

负载方式：姜黄素与环糊精的主客体包合作用

检测方法：OD值检测法，具体地，以V_DPBS:DMSO=（4：1）为释放介质测试微针贴片中姜黄素的释放行为，通过紫外光谱仪定期检测释放介质中OD=430nm处的紫外吸收峰

研究结果：基于GelMA接枝β-环糊精的微针贴片。利用环糊精对疏水药物的包载作用将抗癌药物姜黄素负载到微针中，通过GelMA水凝胶模拟的黑色素瘤模型验证了该载药贴片的肿瘤治疗效果^[7]。

参考资料：

https://doi.org/10.1002/adhm.202000527

2. Advanced Healthcare Materials：3D打印水凝胶结构以调控生长因子的释放

研究材料：甲基丙烯酸缩水甘油酯改性透明质酸（HA-GM）、巯基化肝素（Hep-SH）

目标生长因子：血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）

负载方式：肝素与生长因子间的静电作用

检测方法：酶联免疫（ELISA）法，具体地，以DPBS为释放介质测试不同打印结构中生长因子的释放行为，通过ELISA定期定量检测生长因子

研究结果：装载生长因子的水凝胶几何形状可以通过3D打印来实现，以便在长时间内预测生长因子的释放动力学^[3]。

参考资料：

https://doi.org/10.1002/adhm.201900977

3. Journal of Extracellular Vesicles：可释放细胞外囊泡的GelMA基水凝胶用于软骨再生

研究材料：GelMA、纳米粘土(nanoclay)、小细胞外囊泡(hUC-MSCs-sEVs)

目标外泌体：人脐带间充质干细胞衍生细胞外囊泡

负载方式：物理混合

检测方法：BCA法蛋白定量检测，具体地，以PBS为释放介质，通过BCA法定期定量检测外泌体的释放曲线

研究结果：GelMA/nanoclay水凝胶持续释放sEV，具有刺激软骨形成和治愈软骨缺损的能力，在治疗软骨缺损方面具有广阔的前景^[5]。

参考资料：

https://doi.org/10.1080/20013078.2020.1778883

参考文献：

[1] D’Souza, Susan. "A review of in vitro drug release test methods for nano-sized dosage forms." Advances in Pharmaceutics 2014 (2014).

[2] Mora, Laura, et al. "Real-time electrochemical monitoring of drug release from therapeutic nanoparticles." Journal of Controlled Release 140.1 (2009): 69-73.

[3] Wang, Pengrui, et al. "Controlled Growth Factor Release in 3D‐Printed Hydrogels." Advanced healthcare materials 9.15 (2020): 1900977.

[4] Fan, Lei, et al. "Exosomes‐Loaded Electroconductive Hydrogel Synergistically Promotes Tissue Repair after Spinal Cord Injury via Immunoregulation and Enhancement of Myelinated Axon Growth." Advanced Science (2022): 2105586.

[5] Hu, Hongxing, et al. "miR-23a-3p-abundant small extracellular vesicles released from Gelma/nanoclay hydrogel for cartilage regeneration." Journal of extracellular vesicles 9.1 (2020): 1778883.

[6] Mathieu, Mathilde, et al. "Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9." Nature communications 12.1 (2021): 1-18.

[7] Zhou, Xingwu, et al. "Biodegradable β‐Cyclodextrin Conjugated Gelatin Methacryloyl Microneedle for Delivery of Water‐Insoluble Drug." Advanced healthcare materials 9.11 (2020): 2000527.

[8] Zhao, Danyang, et al. "GelMA combined with sustained release of HUVECs derived exosomes for promoting cutaneous wound healing and facilitating skin regeneration." Journal of Molecular Histology 51.3 (2020): 251-263.