水凝胶抗氧化性能表征

水凝胶的抗氧化性能，是指能够高效清除体内过量产生的自由基与活性氧（ROS），有效缓解氧化应激损伤，在慢性伤口愈合、抗炎修复、皮肤抗衰、骨组织工程等生物医学领域具备极高的应用潜力。在相关课题研究中，研究者通常选取DPPH、ABTS、PTIO、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O₂⁻·）五大经典自由基模型，并结合体外标准化化学检测手段（如电子顺磁共振（ESR）技术），以及细胞层面采用DCFH-DA和DAF‑FMDA荧光探针检测法、组织层面运用DHE荧光探针法，全方位、多层次地评估水凝胶的自由基清除能力与整体抗氧化活性，从而确保表征结果全面且贴合实际生物应用场景。

本期，EFL将为大家解读几种常见的水凝胶抗氧化检测手段，并通过案例分析具体的检测方法、结果解读与科研应用思路。

检测步骤：

1.配制0.1mmol/L左右的DPPH乙醇溶液，避光备用，同时将抗氧化材料剪碎、浸提或直接制备成凝胶悬液，设置空白对照组（无凝胶的纯溶剂）和阳性对照组（常用维生素C、没食子酸）；

2.将材料样品液与等体积DPPH溶液充分混合，室温下避光孵育30-60min（时间可根据试验设计调整，保证反应充分）；

3.孵育结束后，采用酶标仪测定517nm处的吸光度值，按照公式计算DPPH自由基清除率。

02 ABTS阳离子自由基清除率检测法

检测步骤：

1.将ABTS粉剂与过硫酸钾溶液混合，室温避光孵育12-16h，制备ABTS⁺自由基工作液，使用无水乙醇或PBS稀释至734nm处吸光度约0.7±0.02，保证检测灵敏度；

2.取适量材料浸提液或凝胶分散液，与稀释后的ABTS⁺工作液混合，室温避光反应5-30min（快速反应型抗氧化剂可缩短反应时间）；

3.反应结束后立即测定734nm处吸光度，同步设置空白组和阳性对照组，代入公式计算ABTS自由基清除率。

03 PTIO自由基清除率检测法

检测步骤：

1.试剂配制：用pH7.4PBS缓冲液配制0.2mmol/LPTIO自由基工作液，现配现用；将材料剪碎后用PBS浸提24h，离心取上清作为待测样品液；设置空白对照组（PBS替代样品液）、阳性对照组（维生素C或谷胱甘肽溶液），每组3个平行样。

2.样品反应：取等体积PTIO工作液与材料浸提液混合，充分混匀后，置于37℃恒温条件下避光孵育60-90min，保证自由基清除反应充分进行。

3.吸光度检测：孵育结束后，将混合液转移至酶标板，采用酶标仪测定557nm处的吸光度值，记录各组数据。

结果计算：自由基清除率（%）=[1-(样品组吸光度-样品空白吸光度)/(空白对照组吸光度-空白本底吸光度)]×100%

04 羟基自由基（・OH）清除率检测法

核心原理：羟基自由基（・OH）是生物体内活性最强、毒性最大的ROS，可通过Fenton反应（Fe²⁺+H₂O₂）体外生成；亚甲基蓝作为显色探针，与・OH反应发生氧化褪色，在665nm处有特征吸收。各类抗氧化材料（如PDANDs、材料、天然提取物等）中的抗氧化成分可竞争性清除・OH，减少亚甲基蓝氧化，使体系吸光度升高，吸光度越高，清除效果越好。该方法反应快速、特异性强，能模拟生理环境中自由基生成与清除过程，是评估抗氧化材料核心活性的关键指标。

检测步骤：

1.试剂配制：依次配制Fe²⁺溶液（如硫酸亚铁溶液，1mM）、H₂O₂溶液（100mM，避光保存）、亚甲基蓝溶液（0.1mM），建立Fenton反应体系；

2.样品干预：向反应体系中加入系列浓度的抗氧化材料样品液（根据预实验确定有效浓度范围，如12.5-200μg/mL），涡旋混匀后快速反应3-5min（无需额外恒温孵育，避免・OH自发衰减）；

3.检测与对照设置：直接测定665nm处吸光度，计算・OH清除率；同步设置空白对照组（无材料）、阳性对照组（经典抗氧化剂如维生素C）、材料空白组（仅材料+溶剂+探针，扣除自身吸光干扰），每组至少3个平行样。

05超氧阴离子自由基（・O₂⁻）清除率检测法

核心原理：超氧阴离子自由基（・O₂⁻）是生物体内ROS的重要前体，参与炎症、损伤等多种病理进程，具有较强氧化性与细胞毒性。体外采用核黄素-甲硫氨酸体系生成・O₂⁻：核黄素在白光照射下以L-甲硫氨酸为电子供体，与氧气反应生成・O₂⁻；硝基四氮唑蓝氯化物（NBT）与・O₂⁻特异性结合生成蓝色甲臜，在560nm处有特征吸收峰。抗氧化材料可通过清除・O₂⁻减少甲臜生成，降低体系吸光度，吸光度越低，・O₂⁻清除能力越强。该方法能模拟炎症微环境下的自由基生成，适配各类材料的针对性抗氧化活性评估。

检测步骤：

1.试剂配制：配制核黄素储备液（10mM，避光保存）、L-甲硫氨酸工作液（10mM，PBS缓冲液pH7.4配制）、NBT工作液（5mM，PBS缓冲液配制，现配现用）；抗氧化材料样品液用适配溶剂（超纯水、PBS等）配制系列浓度（12.5-200μg/mL），纳米材料需超声处理10min确保分散均匀；

2.反应体系构建：向离心管或酶标板中依次加入L-甲硫氨酸工作液、核黄素工作液、NBT工作液，再加入等体积材料样品液，涡旋混匀；

3.孵育与检测：将体系置于白光照射下（光照距离10-15cm），室温孵育2h；孵育结束后测定560nm处吸光度，计算・O₂⁻清除率；设置空白对照组、阳性对照组、材料空白组，确保检测条件（光照强度、孵育时间）一致。

结果计算：自由基清除率（%）=[1-(样品组吸光度-样品空白吸光度)/(空白对照组吸光度-空白本底吸光度)]×100%

06细胞内活性氧（ROS）荧光标记法（DCFH-DA荧光探针检测法）

检测步骤：

1.培养L929成纤维细胞、HUVEC内皮细胞或巨噬细胞，采用H₂O₂、脂多糖（LPS）、Rosup等试剂诱导构建细胞氧化应激模型，模拟体内氧化损伤环境；

2.将抗氧化材料浸提液与细胞共培养，再加入DCFH-DA荧光探针孵育20-30min，避光操作避免荧光淬灭；

3.用PBS清洗细胞后，通过荧光显微镜观察细胞内荧光分布，或用流式细胞仪定量检测平均荧光强度，对比空白组、模型组判断抗氧化保护效果。

结果判读：模型组细胞呈现强绿色荧光，抗氧化材料处理组荧光信号显著减弱，说明材料可有效清除细胞内ROS，缓解细胞氧化应激损伤，该方法是连接体外化学检测与体内动物实验的关键桥梁。

07细胞内活性氧（RNS）荧光标记法（DAF-FMDA荧光探针检测法）

检测步骤：

1.细胞培养与模型构建：培养L929成纤维细胞、HUVEC内皮细胞或巨噬细胞，采用脂多糖（LPS）诱导细胞产生大量NO，构建亚硝化应激细胞模型，模拟体内炎症微环境下的NO过量生成状态；

2.样品共培养与探针孵育：将抗氧化材料浸提液与NO应激模型细胞共培养一定时间（通常24h），随后加入DAF-FMDA荧光探针，37℃、5%CO₂培养箱中避光孵育20-30min，确保探针充分进入细胞并完成活化；

3.清洗与检测：用预温的PBS缓冲液轻轻清洗细胞3次，去除未进入细胞的游离探针，避免荧光干扰；通过荧光显微镜观察细胞内荧光分布、拍照记录，或用流式细胞仪定量检测细胞平均荧光强度，同步设置正常细胞组、NO应激模型组、样品处理组、阳性对照组（如L-精氨酸抑制剂）。

结果判读：NO应激模型组细胞呈现强绿色荧光，表明细胞内NO含量较高；抗氧化材料处理组细胞荧光信号显著减弱，荧光强度越低，说明材料清除细胞内NO、缓解亚硝化应激的能力越强；结合荧光图片的荧光分布均匀度，可进一步判断材料对细胞内NO的清除效果，为材料抗炎抗氧化机制研究提供细胞层面的直接证据。

08 DHE荧光探针法组织内活性氧（ROS）荧光标记法

检测步骤：

1.动物模型构建与样品处理：根据研究目标构建相应病理模型（如炎症模型、损伤模型、衰老模型等），选取目标检测组织（如肠道、肝脏、肾脏、皮肤、肺组织等）；将实验动物分为正常对照组、病理模型组、抗氧化材料处理组、阳性对照组（如临床抗氧化药物），按实验设计完成给药或干预后，处死动物并快速分离目标组织。

2.组织切片制备：将新鲜目标组织用生理盐水冲洗干净，去除组织表面残留的血液、分泌物或内容物，避免杂质干扰；液氮速冻后置于-80℃保存，或直接进行冷冻切片；用冷冻切片机将组织切成5-10μm厚的冷冻切片，贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上，室温晾干备用（避免组织脱落）。

3.探针孵育与清洗：向组织切片上均匀滴加终浓度8-10μM的DHE荧光探针工作液，确保探针完全覆盖组织切片；将载玻片放入湿盒中，37℃避光孵育30-45min（根据组织类型调整，致密组织可延长至60min），确保探针充分进入组织细胞并完成氧化活化；孵育结束后，用预温至37℃的PBS缓冲液轻轻清洗切片3次（每次5min），去除未进入细胞的游离探针，避免荧光干扰。

4.复染与检测：滴加DAPI染液（终浓度1μg/mL），室温避光孵育10min，对细胞核进行复染，便于定位组织细胞结构；PBS清洗2次后，用抗荧光淬灭剂封片；通过荧光显微镜观察组织内红色荧光分布与强度，拍照记录（随机选取3-5个不同视野，确保覆盖组织关键区域）；用ImageJ软件定量分析平均荧光密度值（OD值）或荧光面积占比，量化组织内ROS水平。

结果判读：正常对照组组织仅呈现微弱红色荧光，表明生理状态下ROS含量低；病理模型组组织呈现强红色荧光，且荧光分布与病理损伤区域高度重合，提示病变组织内ROS大量积累；抗氧化材料处理组组织的红色荧光信号显著减弱，荧光强度接近正常对照组，说明材料能高效清除病变组织内的过量ROS，缓解氧化应激损伤。通过对比材料处理组与对照组（如未修饰材料、临床药物）的荧光强度，可验证材料的抗氧化优势；结合组织病理染色（如H&E染色），能进一步关联ROS清除效果与组织损伤修复程度，为材料在体抗氧化治疗机制提供直接的组织层面证据。

09 活性氧（ROS）/活性氮（RNS）电子顺磁共振（ESR）检测法

核心原理：ESR（电子顺磁共振）技术基于未成对电子的磁共振特性，是自由基直接定性与定量检测的金标准。自由基作为含未成对电子的活性物质，在静磁场中会发生能级分裂，施加特定频率微波辐射时，电子在能级间跃迁产生共振信号，信号强度与自由基浓度呈正相关。实验选用5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物（DMPO）、α-苯基-N-叔丁基硝酮（PBN）等特异性捕获剂，与短寿命自由基快速结合形成稳定自旋加合物，延长检测窗口。通过对比加入抗氧化材料前后的ESR共振信号强度，可直接量化材料的自由基清除效率，为其广谱抗氧化活性提供分子层面直接证据，补充紫外-可见光谱法、荧光探针法等间接检测的可靠性，适配各类抗氧化材料的核心性能表征。

检测步骤：

1.试剂配制与体系构建：

配制系列自由基发生体系：・OH由H₂O₂与Fe²⁺通过Fenton反应生成，・O₂⁻由核黄素与L-甲硫氨酸在白光照射下生成，DPPH・、ABTS⁺・直接用无水乙醇或缓冲液溶解配制；

配制捕获剂溶液：DMPO终浓度50-100mM（适配・OH、・O₂⁻检测），PBN终浓度10-20mM（适配脂溶性自由基检测）；

配制抗氧化材料样品溶液：根据材料特性，用超纯水、PBS缓冲液或无水乙醇配制系列浓度（0.1-200μg/mL），确保材料充分分散或溶解，避免团聚。

2.样品与自由基体系共孵育：按比例将抗氧化材料样品溶液与自由基发生体系混合，涡旋振荡10-15s混匀；立即加入捕获剂，快速颠倒混匀后，迅速转移至ESR石英毛细管中（避免气泡产生）；设置空白对照组（仅含溶剂与捕获剂）、自由基模型组（不含材料的自由基体系+捕获剂）、阳性对照组（经典抗氧化剂如维生素C、谷胱甘肽+自由基体系+捕获剂），每组设置3个平行样。

3.ESR信号检测：将石英毛细管放入ESR光谱仪样品腔，设定统一检测参数：微波功率10-20mW、中心磁场3400-3500G、扫描范围100-200G、扫描时间3-5min、调制幅度0.5-1G；启动仪器采集信号，记录各组ESR共振谱图、峰高及峰面积数据。

4.数据处理与分析：

用ESR光谱分析软件读取各组共振峰特征参数（峰高、峰面积）；以自由基模型组信号强度为基准，计算不同浓度抗氧化材料对目标自由基的清除率（清除率=（模型组信号强度-样品组信号强度）/模型组信号强度×100%）；绘制浓度-清除率曲线，明确材料抗氧化活性的浓度依赖性，计算半数清除浓度（EC₅₀）以量化抗氧化能力。

结果判读：自由基模型组会出现特征性ESR共振峰（・OH-DMPO加合物呈4重对称峰，・O₂⁻-DMPO加合物呈6重峰，DPPH・呈单一尖锐峰），且信号强度高，表明体系中自由基含量丰富；加入抗氧化材料后，共振峰的峰高与峰面积显著降低，降低幅度随材料浓度升高而增大，说明材料能有效捕获或清除目标自由基。

案例解读

案例一：Advanced Science（IF=14.1）聚多巴胺纳米点通过恢复氧化还原稳态改善炎症性肠病2025.08.23

简介：该研究设计制备聚多巴胺纳米点（PDANDs），凭借其本征广谱自由基清除活性，高效清除肠道过量活性氧（ROS）与活性氮（RNS），恢复氧化还原平衡，实现炎症性肠病靶向抗氧化治疗。

参考资料：

https://doi.org/10.1002/advs.202508674

图1 聚多巴胺纳米点（PDANDs）的抗氧化性能表征

图2 经不同处理后的Caco-2细胞的DCFH-DA荧光图像

图3 以DHE作为荧光探针不同结肠组织样本中活性氧（ROS）的荧光图像

检测手段：DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、羟基自由基（・OH）清除法、超氧阴离子（・O₂⁻）清除法、PTIO・清除法、DCFH‑DA荧光探针法、DHE荧光探针法、ESR电子顺磁共振法

检测结果：

（1）研究者以DPPH、ABTS、・OH、・O₂⁻、PTIO・为自由基模型，结果显示PDANDs呈浓度依赖性高效清除各类ROS/RNS，100μg/mL可清除超70%羟基自由基，抗氧化能力显著优于传统PDA纳米颗粒。

（2）ESR结果直接证实，PDANDs可显著降低DMPO-・OH与DMPO-・O₂⁻特征信号，直接淬灭短寿命高活性氧自由基。

（3）细胞与组织水平采用DCFH‑DA与DHE探针检测，Rosup诱导后Caco-2细胞内ROS显著升高，PDANDs处理后绿色/红色荧光强度显著下。

案例二：Journal of Nanobiotechnology（IF=12.6）碳点纳米酶材料调控氧化应激促进牙髓炎牙髓再生2024.09.04

简介：该研究将氮掺杂碳点纳米酶（C‑NZ）载入可注射光固化GelMA材料中，构建C‑NZ/GelMA抗氧化体系，依托碳点纳米酶的高效自由基清除能力，实现对活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的同步清除，改善牙髓炎氧化应激微环境。

参考资料：

https://doi.org/10.1186/s12951-024-02810-z

图4 ABTS•+水溶液以及DPPH溶液在添加不同浓度C-NZ条件下的吸收光谱

图5 C-NZ/GelMA材料在抗氧化方面的作用

检测手段：ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法、DCFH‑DA荧光探针法、DAF‑FMDA荧光探针法

检测结果：

（1）研究者以ABTS、DPPH自由基为体外评估模型，测试C‑NZ/GelMA材料的总抗氧化能力，结果显示C‑NZ/GelMA材料可高效清除ABTS与DPPH自由基，且清除效果呈浓度依赖性，显著优于纯GelMA材料，证明碳点纳米酶赋予材料优异的体外抗氧化性能。

（2）采用DCFH‑DA荧光探针检测Pg‑LPS诱导的人牙髓干细胞内总ROS水平，荧光图像与定量分析表明，C‑NZ/GelMA材料可显著降低细胞内绿色荧光强度，将高表达的ROS恢复至接近正常水平，有效缓解细胞氧化损伤。

（3）利用DAF‑FMDA荧光探针检测细胞内活性氮（・NO）水平，结果显示C‑NZ/GelMA材料可明显减弱荧光信号，高效清除炎症微环境中过量的・NO，同步实现ROS与RNS的双重清除，为牙髓细胞提供保护。

案例三：Advanced Functional Materials（IF=19）负载石榴皮单宁的细胞膜囊泡生物墨水用于抗氧化与软骨再生修复2025.05.25

简介：该研究将负载石榴皮单宁（PUN）的软骨细胞膜囊泡（CMVs）与甲基丙烯酰化丝胶蛋白（SerMA）结合，构建PUN@SerMA‑mCMV生物墨水，依托石榴皮单宁的多羟基结构，实现高效清除活性氧（ROS），为软骨修复提供抗氧化微环境。

参考资料：

https://doi.org/10.1002/adfm.202504180

图6 PUN@SerMA‑mCMV生物墨水的抗氧化性能表征

检测手段：

DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、DCFH‑DA荧光探针法

检测结果：

（1）研究者以DPPH、ABTS自由基为体外评估模型，测试PUN@SerMA‑mCMV材料的自由基清除能力，结果显示该材料对DPPH自由基清除率约79.82%，对ABTS自由基清除率高达94.28%，显著高于纯SerMA材料，证明石榴皮单宁赋予生物墨水优异的总抗氧化能力。

（2）采用DCFH‑DA荧光探针检测H₂O₂诱导的软骨细胞内ROS水平，荧光图像显示PUN@SerMA‑mCMV材料可显著降低细胞内绿色荧光强度，ROS清除率达93.0%，有效缓解细胞氧化应激损伤。

EFL小贴士：

通过对以上9种常见抗氧化检测手段的学习，研究者可从体外化学层面、细胞层面、组织层面及分子层面综合分析抗氧化材料的抗氧化性能。其中，不同检测手段各有优势与适配场景：ESR检测法作为自由基直接定性定量的“金标准”，可精准捕获・OH、・O₂⁻等短寿命自由基，结果可信度最高；DCFH-DA、DAF-FM DA、DHE三种荧光探针法分别实现细胞内ROS、RNS及组织内ROS的可视化检测，能直观呈现材料在生物体内的抗氧化效果；DPPH、ABTS、PTIO、・OH、・O₂⁻五种体外化学检测法操作简便、成本较低，适合抗氧化材料的高通量筛选与初步活性评估。研究者可根据实验需求（如材料筛选阶段、机制验证阶段）、检测对象（自由基类型、样本类型）及精度要求，组合多种检测方法（如体外化学法+细胞/组织荧光法+ESR验证），全面、系统地表征材料的广谱抗氧化活性，确保实验结果的科学性与可靠性。